Optimizacija uslova ekspresije humanog α-sinukleina fuzonisanog sa mCerulean3 fluorescentnim proteinom u bakteriji Escherichia coli
Само за регистроване кориснике
2020
Дипломски рад (Објављена верзија)
,
Univerzitet u Beogradu - Hemijski fakultet
Метаподаци
Приказ свих података о документуАпстракт
U ovom radu optimizovani su uslovi proizvodnje α-sinukleina u fuziji sa fluorescentnim mCerulean3 proteinom. Za ekspresiju proteina u E. coli su korišćena dva medijuma (LB sa glicerolom kao izvorom ugljenika i autoindukcioni medijum). Može se očekivati da se iz ćelija gajenih na LB medijumu prečisti >20 mg/L proteina, dok autoindukcioni medijum, iako daje nižu koncentraciju proteina u ćeliji, daje veću količinu biomase, pa se može očekivati čak i preko 100 mg/L proteina iz bakterija gajenih u ovom medijumu. Takođe, nakon jednog prečišćavanja na IMAC dobijeni protein je bio oko 70% čistoće.
U ovom radu kao metoda za liziranje korišćena je sonikacija uz odmrzavanje i zamrzavanje. Međutim, najverovatnije da ćelije nisu bile u potpunosti lizirane, pa bi verovatno za dalje izolovanje bilo više puta ponoviti ultrazvučni tretman uz zamrzavanja i odmrzavanje. S obzirom na prisustvo His taga u ovom konstruktu, prečišćavanje IMAC-om je metoda prvog izbora koja obezbeđuje visok stepen prečišćeno...sti u jednom koraku. Potrebno bi bilo optimizovati uslove prečišćavanja, npr. promenom pufera za ispiranje nevezanih proteina ili promenom metalnog jona (npr. korišćenje Co2+) vezanog za helirajući matriks.
Iako postoji mogućnost oligomerizacije α-sinukleina u fuziji sa fluorescentnim mCerulean3 proteinom, do nje, pod uslovima u kojima je ovde eksprimiran protein, ne dolazi. S obzirom da fuzioni partner mCerulean3 fluorescira, vizuelizacija i praćenje hromatografskih koraka su jednostavni za izvođenje.
Кључне речи:
α-sinuklein / Escherichia coli / rekombinantni proteiniИзвор:
2020, 2-53Колекције
Институција/група
Hemijski fakultet / Faculty of ChemistryTY - THES AU - Pantelić, Ana PY - 2020 UR - https://cherry.chem.bg.ac.rs/handle/123456789/4145 AB - U ovom radu optimizovani su uslovi proizvodnje α-sinukleina u fuziji sa fluorescentnim mCerulean3 proteinom. Za ekspresiju proteina u E. coli su korišćena dva medijuma (LB sa glicerolom kao izvorom ugljenika i autoindukcioni medijum). Može se očekivati da se iz ćelija gajenih na LB medijumu prečisti >20 mg/L proteina, dok autoindukcioni medijum, iako daje nižu koncentraciju proteina u ćeliji, daje veću količinu biomase, pa se može očekivati čak i preko 100 mg/L proteina iz bakterija gajenih u ovom medijumu. Takođe, nakon jednog prečišćavanja na IMAC dobijeni protein je bio oko 70% čistoće. U ovom radu kao metoda za liziranje korišćena je sonikacija uz odmrzavanje i zamrzavanje. Međutim, najverovatnije da ćelije nisu bile u potpunosti lizirane, pa bi verovatno za dalje izolovanje bilo više puta ponoviti ultrazvučni tretman uz zamrzavanja i odmrzavanje. S obzirom na prisustvo His taga u ovom konstruktu, prečišćavanje IMAC-om je metoda prvog izbora koja obezbeđuje visok stepen prečišćenosti u jednom koraku. Potrebno bi bilo optimizovati uslove prečišćavanja, npr. promenom pufera za ispiranje nevezanih proteina ili promenom metalnog jona (npr. korišćenje Co2+) vezanog za helirajući matriks. Iako postoji mogućnost oligomerizacije α-sinukleina u fuziji sa fluorescentnim mCerulean3 proteinom, do nje, pod uslovima u kojima je ovde eksprimiran protein, ne dolazi. S obzirom da fuzioni partner mCerulean3 fluorescira, vizuelizacija i praćenje hromatografskih koraka su jednostavni za izvođenje. T1 - Optimizacija uslova ekspresije humanog α-sinukleina fuzonisanog sa mCerulean3 fluorescentnim proteinom u bakteriji Escherichia coli SP - 2 EP - 53 UR - https://hdl.handle.net/21.15107/rcub_cherry_4145 ER -
@misc{ author = "Pantelić, Ana", year = "2020", abstract = "U ovom radu optimizovani su uslovi proizvodnje α-sinukleina u fuziji sa fluorescentnim mCerulean3 proteinom. Za ekspresiju proteina u E. coli su korišćena dva medijuma (LB sa glicerolom kao izvorom ugljenika i autoindukcioni medijum). Može se očekivati da se iz ćelija gajenih na LB medijumu prečisti >20 mg/L proteina, dok autoindukcioni medijum, iako daje nižu koncentraciju proteina u ćeliji, daje veću količinu biomase, pa se može očekivati čak i preko 100 mg/L proteina iz bakterija gajenih u ovom medijumu. Takođe, nakon jednog prečišćavanja na IMAC dobijeni protein je bio oko 70% čistoće. U ovom radu kao metoda za liziranje korišćena je sonikacija uz odmrzavanje i zamrzavanje. Međutim, najverovatnije da ćelije nisu bile u potpunosti lizirane, pa bi verovatno za dalje izolovanje bilo više puta ponoviti ultrazvučni tretman uz zamrzavanja i odmrzavanje. S obzirom na prisustvo His taga u ovom konstruktu, prečišćavanje IMAC-om je metoda prvog izbora koja obezbeđuje visok stepen prečišćenosti u jednom koraku. Potrebno bi bilo optimizovati uslove prečišćavanja, npr. promenom pufera za ispiranje nevezanih proteina ili promenom metalnog jona (npr. korišćenje Co2+) vezanog za helirajući matriks. Iako postoji mogućnost oligomerizacije α-sinukleina u fuziji sa fluorescentnim mCerulean3 proteinom, do nje, pod uslovima u kojima je ovde eksprimiran protein, ne dolazi. S obzirom da fuzioni partner mCerulean3 fluorescira, vizuelizacija i praćenje hromatografskih koraka su jednostavni za izvođenje.", title = "Optimizacija uslova ekspresije humanog α-sinukleina fuzonisanog sa mCerulean3 fluorescentnim proteinom u bakteriji Escherichia coli", pages = "2-53", url = "https://hdl.handle.net/21.15107/rcub_cherry_4145" }
Pantelić, A.. (2020). Optimizacija uslova ekspresije humanog α-sinukleina fuzonisanog sa mCerulean3 fluorescentnim proteinom u bakteriji Escherichia coli. , 2-53. https://hdl.handle.net/21.15107/rcub_cherry_4145
Pantelić A. Optimizacija uslova ekspresije humanog α-sinukleina fuzonisanog sa mCerulean3 fluorescentnim proteinom u bakteriji Escherichia coli. 2020;:2-53. https://hdl.handle.net/21.15107/rcub_cherry_4145 .
Pantelić, Ana, "Optimizacija uslova ekspresije humanog α-sinukleina fuzonisanog sa mCerulean3 fluorescentnim proteinom u bakteriji Escherichia coli" (2020):2-53, https://hdl.handle.net/21.15107/rcub_cherry_4145 .