Kloniranje i ekspresija fluorescentno obeleženog )-sinukleina u bakteriji Escherichia coli
Cloning and expression of fluorescently labeled )-synuclein in Eschierichia coli
Конференцијски прилог (Објављена верзија)
Метаподаци
Приказ свих података о документуАпстракт
Fluorescentno obeleženi proteini su neprocenjivi alati u laboratorijskoj praksi za in vivo lokalizovanje i ispitivanje interakcija proteina. Dizajnirali smo vektor za ekspresiju mCerulean3 sa N-terminalnim heksahistidinskim obeleživacem fuzionisanim preko poliasparaginskog linkera i proteolitickog mesta za proteazu virusa graviranosti duvana (TEV) sa -sinukleinom. Ovaj konstrukt može se upotrebiti za proizvodnju -sinukleina nativne sekvence nakon proteolize TEV proteazom. Gen za mCerulean3 je nizom lancanih reakcija polimeraze (SOEing PCR) fuzionisan sa genom za -sinuklein i nakon amplifikacije ukloniran u plazmid pDUET-1. Escherichia coli BL21(DE3) je, nakon transformacije ovim konstruktom, upotrebljena za proizvodnju himernog proteina koji je zadržao fluorescentna svojstva sa prinosom od ~2 mg po litru medijuma nakon precišcavanja imobilizovanom metal-afinitetnom hromatografijom (elektroforetska cistoca: ~80%). Ovaj himerni protein je uspešno proteolizovan TEV proteazom.
Fluorescently labeled proteins are invaluable tools in laboratory practice to assess the in vivo localization and the interactions of proteins. Here we have designed an expression vector with an N-terminal hexahistidine-tagged mCerulean3 fused through a polyasparagine linker and the proteolytic site of tobacco etch virus protease (TEV) to - synuclein. This construct can be used to produce -synuclein of a native sequence after proteolysis with TEV protease. After fusion of the genes for mCerulean3 and -synuclein through a series of polymerase chain reactions (SOEing PCR), the resulting gene for the chimeric protein was cloned into the pDUET-1 plasmid. Escherichia coli BL21(DE3), upon transformation with this construct, can be used to produce the chimeric protein that retained the fluorescent properties of mCerulean3, with a yield of ~2 mg per liter of medium after purification by immobilized metal-affinity chromatography (electrophoretic purity: ~80%). This chimeric protein was successf...ully proteolyzed by TEV protease.
Извор:
58. Savetovanje Srpskog hemijskog društva, Kratki izvodi radova, Beograd 9. i 10. jun 2022. godine, 2022, 68-68Издавач:
- Beograd : Srpsko hemijsko društvo
Финансирање / пројекти:
- LEAPSyn-SCI - Late Embryogenesis Abundant Proteins: Structural Characterisation and Interaction With Α-Synuclein (RS-6039663)
- Министарство науке, технолошког развоја и иновација Републике Србије, институционално финансирање - 200168 (Универзитет у Београду, Хемијски факултет) (RS-200168)
Напомена:
Колекције
Институција/група
Hemijski fakultet / Faculty of ChemistryTY - CONF AU - Savić, Aleksa D. AU - Vidović, Marija AU - Radosavljević, Jelena PY - 2022 UR - http://cherry.chem.bg.ac.rs/handle/123456789/5373 AB - Fluorescentno obeleženi proteini su neprocenjivi alati u laboratorijskoj praksi za in vivo lokalizovanje i ispitivanje interakcija proteina. Dizajnirali smo vektor za ekspresiju mCerulean3 sa N-terminalnim heksahistidinskim obeleživacem fuzionisanim preko poliasparaginskog linkera i proteolitickog mesta za proteazu virusa graviranosti duvana (TEV) sa -sinukleinom. Ovaj konstrukt može se upotrebiti za proizvodnju -sinukleina nativne sekvence nakon proteolize TEV proteazom. Gen za mCerulean3 je nizom lancanih reakcija polimeraze (SOEing PCR) fuzionisan sa genom za -sinuklein i nakon amplifikacije ukloniran u plazmid pDUET-1. Escherichia coli BL21(DE3) je, nakon transformacije ovim konstruktom, upotrebljena za proizvodnju himernog proteina koji je zadržao fluorescentna svojstva sa prinosom od ~2 mg po litru medijuma nakon precišcavanja imobilizovanom metal-afinitetnom hromatografijom (elektroforetska cistoca: ~80%). Ovaj himerni protein je uspešno proteolizovan TEV proteazom. AB - Fluorescently labeled proteins are invaluable tools in laboratory practice to assess the in vivo localization and the interactions of proteins. Here we have designed an expression vector with an N-terminal hexahistidine-tagged mCerulean3 fused through a polyasparagine linker and the proteolytic site of tobacco etch virus protease (TEV) to - synuclein. This construct can be used to produce -synuclein of a native sequence after proteolysis with TEV protease. After fusion of the genes for mCerulean3 and -synuclein through a series of polymerase chain reactions (SOEing PCR), the resulting gene for the chimeric protein was cloned into the pDUET-1 plasmid. Escherichia coli BL21(DE3), upon transformation with this construct, can be used to produce the chimeric protein that retained the fluorescent properties of mCerulean3, with a yield of ~2 mg per liter of medium after purification by immobilized metal-affinity chromatography (electrophoretic purity: ~80%). This chimeric protein was successfully proteolyzed by TEV protease. PB - Beograd : Srpsko hemijsko društvo C3 - 58. Savetovanje Srpskog hemijskog društva, Kratki izvodi radova, Beograd 9. i 10. jun 2022. godine T1 - Kloniranje i ekspresija fluorescentno obeleženog )-sinukleina u bakteriji Escherichia coli T1 - Cloning and expression of fluorescently labeled )-synuclein in Eschierichia coli SP - 68 EP - 68 UR - https://hdl.handle.net/21.15107/rcub_cherry_5373 ER -
@conference{ author = "Savić, Aleksa D. and Vidović, Marija and Radosavljević, Jelena", year = "2022", abstract = "Fluorescentno obeleženi proteini su neprocenjivi alati u laboratorijskoj praksi za in vivo lokalizovanje i ispitivanje interakcija proteina. Dizajnirali smo vektor za ekspresiju mCerulean3 sa N-terminalnim heksahistidinskim obeleživacem fuzionisanim preko poliasparaginskog linkera i proteolitickog mesta za proteazu virusa graviranosti duvana (TEV) sa -sinukleinom. Ovaj konstrukt može se upotrebiti za proizvodnju -sinukleina nativne sekvence nakon proteolize TEV proteazom. Gen za mCerulean3 je nizom lancanih reakcija polimeraze (SOEing PCR) fuzionisan sa genom za -sinuklein i nakon amplifikacije ukloniran u plazmid pDUET-1. Escherichia coli BL21(DE3) je, nakon transformacije ovim konstruktom, upotrebljena za proizvodnju himernog proteina koji je zadržao fluorescentna svojstva sa prinosom od ~2 mg po litru medijuma nakon precišcavanja imobilizovanom metal-afinitetnom hromatografijom (elektroforetska cistoca: ~80%). Ovaj himerni protein je uspešno proteolizovan TEV proteazom., Fluorescently labeled proteins are invaluable tools in laboratory practice to assess the in vivo localization and the interactions of proteins. Here we have designed an expression vector with an N-terminal hexahistidine-tagged mCerulean3 fused through a polyasparagine linker and the proteolytic site of tobacco etch virus protease (TEV) to - synuclein. This construct can be used to produce -synuclein of a native sequence after proteolysis with TEV protease. After fusion of the genes for mCerulean3 and -synuclein through a series of polymerase chain reactions (SOEing PCR), the resulting gene for the chimeric protein was cloned into the pDUET-1 plasmid. Escherichia coli BL21(DE3), upon transformation with this construct, can be used to produce the chimeric protein that retained the fluorescent properties of mCerulean3, with a yield of ~2 mg per liter of medium after purification by immobilized metal-affinity chromatography (electrophoretic purity: ~80%). This chimeric protein was successfully proteolyzed by TEV protease.", publisher = "Beograd : Srpsko hemijsko društvo", journal = "58. Savetovanje Srpskog hemijskog društva, Kratki izvodi radova, Beograd 9. i 10. jun 2022. godine", title = "Kloniranje i ekspresija fluorescentno obeleženog )-sinukleina u bakteriji Escherichia coli, Cloning and expression of fluorescently labeled )-synuclein in Eschierichia coli", pages = "68-68", url = "https://hdl.handle.net/21.15107/rcub_cherry_5373" }
Savić, A. D., Vidović, M.,& Radosavljević, J.. (2022). Kloniranje i ekspresija fluorescentno obeleženog )-sinukleina u bakteriji Escherichia coli. in 58. Savetovanje Srpskog hemijskog društva, Kratki izvodi radova, Beograd 9. i 10. jun 2022. godine Beograd : Srpsko hemijsko društvo., 68-68. https://hdl.handle.net/21.15107/rcub_cherry_5373
Savić AD, Vidović M, Radosavljević J. Kloniranje i ekspresija fluorescentno obeleženog )-sinukleina u bakteriji Escherichia coli. in 58. Savetovanje Srpskog hemijskog društva, Kratki izvodi radova, Beograd 9. i 10. jun 2022. godine. 2022;:68-68. https://hdl.handle.net/21.15107/rcub_cherry_5373 .
Savić, Aleksa D., Vidović, Marija, Radosavljević, Jelena, "Kloniranje i ekspresija fluorescentno obeleženog )-sinukleina u bakteriji Escherichia coli" in 58. Savetovanje Srpskog hemijskog društva, Kratki izvodi radova, Beograd 9. i 10. jun 2022. godine (2022):68-68, https://hdl.handle.net/21.15107/rcub_cherry_5373 .