Show simple item record

Kloniranje gena za ugljeni hidrat oksidazu iz biljke Lactuca sativa u kvasce saccharomyces cerevisiae i Pichia pastoris

dc.creatorTadić, Vojin
dc.creatorBalaž, Ana Marija
dc.creatorPetric, Marija P.
dc.creatorMilošević, Snežana
dc.creatorZelenović, Nevena D.
dc.creatorRaspor, Martin Z.
dc.creatorTadić, Jovan
dc.creatorProdanović, Radivoje
dc.date.accessioned2018-11-22T00:33:32Z
dc.date.available2018-11-22T00:33:32Z
dc.date.issued2015
dc.identifier.issn0367-598X
dc.identifier.urihttp://cherry.chem.bg.ac.rs/handle/123456789/2040
dc.description.abstractWe have cloned the gene for carbohydrate oxidase (CHO) from Lactuca sativa in two species of yeasts (Saccharomyces cerevisiae and Pichia pastoris). The synthetic gene for the carbohydrate oxidase (1821 bp) from L. sativa cloned into the vector pUC57 and inserted into plasmids pYES2 and pGAP using Escherichia coli DH5 alpha strain. The P. pastoris strain X-33 and the S. cerevisiae strain InvSC1 were used for extracellular expression of CHO. After transformation of P. pastoris X-33 with CHO-pGAP construct none of the colonies showed CHO activity. Two samples displayed a band which did not exist in the sample with the empty vector similar to the molecular weight of CHO. The S. cerevisiae strain InvSC1 has been also transformed with CHO-pYES constructs. Three colonies grew on the plate with cells transformed with the construct. One of the samples showed a band corresponding to about 110 kDa, but no CHO activity was recorded in this case either. Cloning of the foreign genes and heterologous expression in yeasts is widely used in biotechnology, but sometimes can be very dependent on the gene sequence and strain used. In order to obtain active CHO enzyme the further studies on purification and refolding of expressed protein are necessary.en
dc.description.abstractUgljeni hidrat-oksidaza (CHO) iz zelene salate (Lactuca sativa) je enzim koji je do danas nedovoljno ispitan. Vrlo se malo zna o njegovoj strukturi i funkciji. CHO pripada velikoj familiji ugljenihidrat-oksidaza, koje oksiduju šećere. Svaki od članova ove velike familije dobio je ime po supstratu koji oksiduje. Oksidaze iz ove familije enzima imaju kako sličnu ulogu tako i sličnu strukutru. Sve ili većina ovih enzima su monomeri, čiji se polipeptidni lanac uvija u dva domena. Jedan od domena vezuje flavinski kofaktor, a drugi domen je supstrat vezujući. Većina njih oksidaciju supstrata vrši po takozvanom ping-pong mehanizmu. Sve oksidaze iz karbohidrat-oksidaza familije, pa među njima i enzim koji je predmet ove studije (CHO), danas su našle veliku primenu u industriji. CHO se može primenjivati kako u medicinskoj djagnostici, konkretno u biosenzorima za određivanje glukoze u krvi, u prehrambenoj industriji, poljoprivredi, proizvodnji hleba, deterdženata i u raznim drugim industrijskim oblastima. Problem sa ovim enzimom, kao i sa ostalim članovima ove familije, jeste niska koncentracija u prirodnim izvorima. Zato su danas razvijene različite metode rekombinantne tehnologije, kojima se dobijaju ovi enzimi. U ovom radu opisano je kloniranje gena za CHO iz zelene salate u dve vrste kvasaca (Saccharomyces cerevisiae i Pichia pastoris). Sintetički gen za CHO (1821 bp) iz zelene salate kloniran je u vektor pUC57. Escherichia coli soj DH5α korišćen je za kloniranje gena i održavanje plazmida. P. pastoris soj X-33 i S. cerevisiae soj InvSC1 korišćeni su za ekstracelularnu ekspresiju CHO. Aktivnost CHO određena je ABST esejom, a promena absorbance merena je na 405 nm. Potvrda prisustva enzima rađena je na DNK agaroznoj elektroforezi i SDS-PAGE. Posle transformacije P. pastoris X-33, nijedan od klonova nije pokazivao aktivnost CHO. Posle prve fermentacije, kolonije su testirane na SDS-PAGE. Kako su dva uzorka pokazala trake, koje ne postoje na praznom vektoru, ove trake bi mogle odgovarati željenom enzimu, CHO. Traka se nalazi na molekulskoj masi koja je veća od teoretske (više od 120 kDa). Enzim bi mogao biti glikolizovan i zbog toga pokazivati ovako velike vrednosti za molekulsku masu. S. cerevisiae soj InvSC1 transformisan je konstruktom CHO-pZES. Posle 24 sata, tri kolonije su porasle na ploči na kojoj su bile ćelije transformisane pomenutim konstruktom. Uzorci su testirani na SDS-PAGE. Jedan uzorak je pokazao traku na oko 110 kDa, ali aktivnost CHO nije potvrđena takođe. Cilj ove studije je bio kloniranje CHO u kvascima S. cerevisiae i P. pastoris, kao i njena ekspresija u ovim, danas široko primenjivanim ekspresionim sistemima.sr
dc.publisherAssoc Chemical Engineers Serbia, Belgrade
dc.rightsopenAccess
dc.sourceHemijska industrija
dc.subjectSaccharomyces cerevisiaeen
dc.subjectPichia pastorisen
dc.subjectPichia pastorisen
dc.subjectcarbohydrate oxidaseen
dc.subjectcarbohydrate oxidaseen
dc.subjectglycosylationen
dc.subjectglycosylationen
dc.subjectSaccharomyces cerevisiaesr
dc.subjectPichia pastorissr
dc.subjectglikozilacijasr
dc.titleCloning of the gene for a carbohydrate oxidase from Lactuca sativa in the yeasts Saccharomyces cerevisiae and Pichia pastorisen
dc.titleKloniranje gena za ugljeni hidrat oksidazu iz biljke Lactuca sativa u kvasce saccharomyces cerevisiae i Pichia pastorissr
dc.typearticle
dc.rights.licenseBY-NC-ND
dcterms.abstractТадиц, Војин М.; Балаз, Aна Марија Ј.; Петриц, Марија П.; Распор, Мартин З.; Милосевиц, Снезана М.; Зеленовиц, Невена Д.; Продановић, Радивоје; Тадиц, Јован М.;
dc.citation.volume69
dc.citation.issue6
dc.citation.spage689
dc.citation.epage701
dc.identifier.wos000369523000011
dc.identifier.doi10.2298/HEMIND140823003T
dc.citation.other69(6): 689-701
dc.citation.rankM23
dc.type.versionpublishedVersion
dc.identifier.scopus2-s2.0-84953298524
dc.identifier.fulltexthttp://cherry.chem.bg.ac.rs/bitstream/id/9070/2038.pdf
dc.identifier.rcubKon_2995


Files in this item

Thumbnail

This item appears in the following Collection(s)

Show simple item record