Antioksidativni metabolizam belog i zelenog tkiva listova panaširane muškatle (Pelargonium zonale) i tamjanike (Plectronthus coleoides) - uticaj zračenja iz veidljive i UV-B oblasti

Abstract

Biljke izabrane kao eksperimentalni modeli za ovu disertaciju bile su panaširanemuškatle (Pelargonium zonale) i tamjanike (Plectranthus coleoides). Zeleno-belopanaširano lišće predstavljalo je odličan sistem za proučavanje uticaja fotosinteze naantioksidativni i fenolni metabolizam, kao i za istraživanje metaboličkih interakcijaizmeđu autotrofnog, „izvor“, tkiva, i heterotrofnog, „uvir“, tkiva unutar istog lista.U svom prirodnom staništu biljke su izložene visokom intenzitetu vidljive svetlostii UV-B zračenju (280-315 nm). Visok intenzitet fotosintetski aktivnog zračenja (PAR,400-700 nm) može da nadjača kapacitet fotosintetske potrošnje i procese energetskograsipanja i da prouzrokuje inhibiciju fotosinteze, CO2 asimilacije i pojačanu akumulacijureaktivnih kiseoničnih vrsta (eng. reactive oxygen species, ROS). Stoga su biljke razvilebrojne mehanizme zaštite, koji uključuju i postojanje specijalizovanih enzimskih ineenzimskih antioksidanata.Cilj istraživanja ove teze bio je određivanje konstitutivnih komponenataantioksidativnog sistema i njihove distribucije u fotosintetski aktivnom i fotosintetskineaktivnom tkivu listova panaširanih vrsta. Pri optimalnim svetlosnim uslovima za rast,aktivnosti enzima askorbat-glutationskog (Asc-GSH) ciklusa, kao i Cu/Zn i Mnsuperoksid-dismutaze su bile veće u belom tkivu, dok su aktivnosti katalaze (CAT) itilakoidne askorbat-peroksidaze (APX) bile veće u zelenom tkivu listova biljaka P. zonale.Biohemijskim i imunocitohemijskim analizama, pomoću transmisione elektronskemikroskopije, pokazano je da je Asc dvostruko više zastupljen u mezofilnim ćelijamazelenog tkiva (u peroksizomima, mitohondrijama i jedru), a GSH u mezofilnim ćelijamabelog tkiva (u mitohondrijama, jedru i citosolu). S obzirom na doprinos fotosinteze ustvaranju reaktivnih kiseoničnih vrsta (eng. reactive oxygen species, ROS), praćen jeodgovor enzimskih komponenata Asc-GSH ciklusa, CAT i peroksidaza III klase u belom izelenom tkivu listova u uslovima stimulisane Melerove reakcije tokom izlaganja biljaka P.zonale visokom intenzitetu PAR-a i tretmanu parakvatom. Ovakav tretman je izazvaoizraženiji odgovor enzimskih komponenti Asc-GSH ciklusa belog tkiva, u odnosu nazeleno, što je ukazalo da je belo tkivo dobro adaptirano protiv oksidativnog stresa. iiiU drugom delu ove disertacije ispitivani su i specifični uticaji ambijentalnog UV-Bzračenja (0.90 W m–2) i visokog intenziteta PAR-a (1350 µmol m–2s–1) na fotosintetskuaktivnost i parametre izmene gasova (CO2 i H2O), kao i na antioksidativni i fenolnimetabolizam panaširanih listova P. coleoides i P. zonale biljaka. Kako bi se izbeglimogući štetni efekti usled neprilagođenog UV-B/UV-A/PAR odnosa, kao i od nerealnihintenziteta i spektralnih karakteristika svih komponenti zračenja, eksperimenti su izvođeniu simulatorima sunčevog zračenja. Pokazano je da je efekat UV-B zračenja bio zavisan odbiljne vrste, ali i od intenziteta pozadinskog PAR-a. U biljkama P. coleoides UV-Bzračenje je stimulisalo brzinu asimilacije CO2 i provodljivost stoma, dok u biljkama P.zonale, UV-B zračenje nije uticalo na fotosintezu, već je preko trehaloznog signalnog putadovelo do degradacije skroba i saharoze, i stimulisalo transport ugljenih hidrata iz zelenogu belo tkivo. Kako je u obe ispitivane biljne vrste UV-B zračenje dovelo do pojačaneakumulacije glikozida hidroksicinamičnih kiselina i flavonoida (sa antocijanima),uglavnom u belom tkivu listova, predložena su dva mehanizma koji kompenzujunedostatak fotosinteze i pojačane anaboličke zahteve u ovom tkivu.Visok intenzitet PAR-a je imao veći efekat na listove P. zonale u odnosu na listoveP. coleoides biljaka. U biljkama P. zonale je stimulisao biosintezu fenilpropanoida iflavonoida sa orto-dihidroksi-supstituisanim B prstenom, a u sinergiji sa UV-B zračenjem,izazvao je porast aktivnosti APX, CAT i sadržaja Asc isključivo u zelenom tkivu listovabiljaka P. zonale. Dobijeni rezultati ukazuju na postojanje različitih aklimatizacionihodgovora na UV-B zračenje u zelenom i belom tkivu biljaka P. zonale.

In this thesis, variegated geranium (Pelargonium zonale) and Swedish ivy(Plectranthus coleoides) were used as model plants. Green-white variegated leaves are anexcellent model system for investigating the effects of photosynthesis on antioxidative andphenolic metabolism, and “source”-“sink” interactions within the same leaf.In their natural habitat, plants are exposed to high light intensity and to UV-Bradiation (280-315 nm). High levels of photosynthetically active radiation (PAR) however,might exceed the the photosynthetic assimilation capacity and energy dissipation processesand provoke inhibition of photosynthesis and enhanced accumulation of reactive oxygenspecies (ROS). Therefore, plants have developed numerous protection mechanisms,including specialized enzymatic and non-enzymatic antioxidants.The aim of this study was to determine constitutive components of antioxidativesystem and their distribution in photosynthetically active and non-active tissues ofvariegated plants. Under optimal light conditions, activities of ascorbate-glutathione (AscGSH)cycle enzymes, Cu/Zn and Mn superoxide dismutases were higher within white leaftissue of P. zonale, while thylakoid ascorbate peroxidase (APX) and catalase (CAT)activities were higher in green leaf tissue. Biochemical and immunocytochemical analysisusing transmission electron microscopy revealed two-fold higher Asc content in mesophyllcells of green leaf tissue (in peroxisomes, mitochondria, nucleus), while GSH was moreabundant in mesophyll cells of white leaf tissue (in mitochondria, nucleus, cytosol). Sincephotosynthesis is the main source of ROS in the leaves, the second aim in this thesis wasto analyze the response of Asc-GSH cycle components, CAT and class III peroxidases ingreen and white leaf tissues, under the conditions of stimulated Mehler reaction during theexposure of P. zonale to high PAR and paraquat. These treatments induced greaterresponse of Asc-GSH cycle enzymes in white leaf tissue, compared with green one,indicative of the development of adaptive mechanisms to avoid oxidative stress. In the second half of this thesis, the specific effects of high PAR (1350 µmol m–2s–1) and ambient UV-B irradiances (0.90 W m–2) on photosynthetic activity and gas vexchange parameters (CO2 and H2O), as well as on antioxidative and phenolic metabolismof variegated P. coleoides and P. zonale plants were studied. In order to avoid possibledetrimental effects caused by unrealistic UV-B/UV-A/PAR ratios, quantity and spectralquality of radiation, the experiments were conducted in unique sun simulators.The results showed that ecologically relevant UV-B radiation-induced responsesare species-specific and dependent on background light. Two mechanisms to compensatethe absence of photosynthetic activity and increased anabolic demands in white, “sink”tissue were proposed. UV-B radiation stimulated CO2 assimilation rate and stomatalconductance in P. coleoides plants. On the other hand, in P. zonale, UV-B radiation,provoked starch and sucrose degradation via the trehalose signalling pathway, andsubsequent sugar transport from green to white tissue, without affecting photosynthesis.UV-B radiation induced enhanced accumulation of hydroxycinnamic acid and flavonoidglycosides, in both variegated species, mostly in white leaf tissue.High PAR had stronger effects on the leaves of P. zonale plants, compared with P.coleoides plants. Additionally, high PAR stimulated specific accumulation ofphenylpropanoids and flavonoids with ortho-dihydroxy B-ring substitution pattern, andsynergistically with UV-B radiation, increased APX and CAT activities and Asc content,exclusively in green leaf tissue of P. zonale plants. Overall, these results show differentialacclimatisation responses to UV-B radiation in green and in white tissue of P. zonaleleaves