Karakterizacija ektoenzima koji hidrolizuju vanćelijski ATP i ADP u uterusu pacova i in vitro uticaj kadmijuma, žive i bakra na aktivnost enzima

Abstract

ATP i drugi purinski nukleotidi su parakrini signalni molekuli koji vezivanjemza purinske receptore (P1 i P2) na ćelijskoj membrani učestvuju u kontrolikontrakcija i modulaciji imunog odgovora u uterusu sisara. Poremećajikontraktilnosti uterusa mogu imati važnu ulogu u nastanku neplodnosti, dismenorejei prevremenog porođaja. U ovom radu ispitano je prisustvo i kinetičke osobineektoenzima koji hidrolizuju vanćelijski ATP i ADP u uterusu pacova (Wistar albino).Takođe, ispitan je in vitro uticaj teških metala (kadmijuma, žive i bakra) kao izaštitni efekat EDTA i L-cisteina na aktivnost ektoenzima u prisustvu jona metala.Rezultati ove studije pokazali su da hidrolizu vanćelijskog ATP i ADP uuterusu pacova katalizuju enzimi iz familije E-NTPDaza. To potvrđuju rezultati:neosetljivosti na inhibitore drugih membranskih ATPaza (oligomicin, ouabain,teofiln i levamisol); pH optimum za maksimalnu aktivnost enzima na alkalnom pH(8.0-8.5) za oba supstrata; zavisnost enzimske aktivnosti od dvovalentnih jona iinhibicija suraminom. Izmerana aktivnost E-NTPDaza u uterusu je veoma visoka uodnosu na ostala tkiva pacova, što se vidi iz dobijenih vrednosti kinetičkihparametara za hidrolizu ATP (Vmax(app)=3.973±0.280 μmol Pi/min/mg,Km(app)=0.506±0.062 mM), odnosno ADP (Vmax(app)=2.854±0.080 μmol Pi/min/mg,Km(app)=0.639±0.031 mM). Slične Km vrednosti za hidrolizu ATP i ADP, odnospočetnih brzina hidrolize ATP/ADP (1:0.57), Chevillard-ova kriva kompeticije ATPi ADP, kao i inhibicija milimolarnim koncentracijama natrijum-azida (5-10 mM)ukazuju da je E-NTPDaza 1 dominantni enzim koji hidrolizuje vanćelijskenukleotide u uterusu pacova. RT-PCR i Western blot analizom pokazana je genska iproteinska ekspresija NTPDaze 1 i 2 u uterusu pacova.U daljem toku istraživanja ispitan je efekat i mehanizma delovanjadvovalentnih jona kadmijuma, žive(II) i bakra(II) na aktivnost E-NTPDaza iz uterusa pacova...

ATP and other purine nucleotides are paracrine signaling molecules. Acting viapurine receptors (P1 and P2) on the cell membrane, extracellular nucleotidesparticipate in the control of contraction and modulation of the immune response inmammalian uterus. Disorder of uterine contractility may play an important role in thedevelopment of infertility, dysmenorrhea and premature labor. In this study, weexamined the presence and kinetic properties of ectoenzymes that hydrolyzeextracellular ATP and ADP in rat uterus (Wistar albino). Also, effects of heavy metalions (cadmium, mercury, and copper) on the activity of ectoenzymes from rat uteruswere studied in vitro, in the absence and presence of EDTA and L-cysteine.This study showed that hydrolysis of extracellular ATP and ADP in rat uterusis catalyzed by enzymes classified as the E-NTPDase family. The following resultsconfirmed common properties characteristic for E-NTPDases: insensitivity toinhibitors of other membrane ATPase (oligomycin, ouabain, theophylline andlevamisole), an alkaline pH optimum for both substrates (8.0-8.5), divalent cationsdependence and significant inhibition by suramine. E-NTPDase activity in rat uterusappeared to be very high compared to other rat tissues. The apparent Km values were0.506±0.062 and 0.639±0.031 mM, with a calculated Vmax(app) of 3.973±0.280 and2.854±0.080 μmol Pi/min/mg for ATP and ADP, respectively. According to similarapparent Km values for both substrates, the ATP/ADP hydrolysis ratio (1:0:57),Chevillard competition plot, and inhibition by high milimolar concentrations ofsodium-azide (5-10 mM), E-NTPDase 1 is dominant ATP/ADP hydrolyzing enzymein uterine cell membranes. RT-PCR and Western blot analysis revealed gene andprotein expression of NTPDaze 1 and 2 in rat uterus.In the further course of research, the effects and mechanism of action ofdivalent ions (mercury, cadmium and copper) on the activity of E-NTPDases fromrat uterus were examined...