Kreiranje biblioteke mutanata jednolančanog varijabilnog regiona monoklonskog antitela u kvascu Saccharomyces cerevisiae EBY 100

Abstract

Cilj ovog rada je stvaranje biblioteke mutanata koja bi poslužila za stvaranje fragmenta anitela sa poboljšanim afinitetom i većom specifičnošću. Najpre su mišije hibridomske ćelije T51 umnožene u Odseku za razvoj Instituta Torlak korišćene kao izvor gena za varijabilne domene lakog i teškog Ig lanca. Korak izolovanja ukupne mRNK i transkripcije u cDNK urađen je u laboratoriji dr Melite Vidaković na Institutu za biološka istraživanja Siniša Stanković. U radu kolege Ognjena Krnjaje, na Hemijskom fakultetu, je korišćena tehnika SOE PCR za konstruisanje gena. Konstruisani gen, koji kodira fuzioni protein, se sastoji od delova dva različita gena (cDNK hibridoma T51). Korišćenjem degenerisanih prajmera sa linkerima za teški lanac, odnosno sa linkerima za laki lanac, dobijena su dva fragmenta koji na krajevima imaju homologne sekvence. Na taj način fragmenti su poslužili kao prajmeri jedan drugom, a nastalo preklapanje se produžava desjtvom Taq polimeraze nakon čega dolazi do formiranja rekombinantnog produkta. Ideja ovog rada je uključivala uvođenje mutacija u prethodno konstruisani gen. Metoda za generisanje slučajnih mutacija, koja je korišćena u ovom radu, jeste error-prone (ep-PCR) u cilju dobijanja specifičnog produkta sa većim afinitetom. Da bi se povećala stopa mutacije, dodavanje jona Mn2+ u PCR smešu pokazala se veoma efikasnom. Amplifikacija gena pod ovim uslovima dovodi do stvaranja populacije molekula koji nose slučajne tačkaste mutacije, što je iskorišćeno za pravljenje biblioteka mutanata. Za kloniranje su izabrane dve metode: standardno kloniranje sa endonukleazama i DNK ligazom, i kloniranje pomoću PCR koristeći mega prajmere. Cilj je uključivao transformisanje i generisanje mnogobrojnih kolonija sa različitim mutantima.