Kloniranje glavne proteaze Mpro SARS-CoV-2 u E.coli, heterologna ekspresija, prečišćavanje i razvoj inhibitornog enzimskog eseja za pretragu potencijalnih lekova

Abstract

SARS-CoV-2 virus predstavlja globalnu pretnju po javno zdravlje. Postojeće mogućnosti prevencije i lečenja SARS-CoV-2 infekcije su nedovoljne zbog nedostatka efikasne terapije lekovima. Pošto razvoj novog leka predstavlja vrlo dug proces i zahteva velika finansijska ulaganja, prenamena odobrenih farmaceutskih lekova i kandidata za lekove predstavlja alternativni pristup koji omogućava identifikaciju potencijalnih lekova za u cilju brzog odgovora na pandemiju. Glavna proteaza Mpro SARS-CoV-2 ima ključnu ulogu u replikaciji virusa. Zbog važne uloge u životnom ciklusu virusa, proteaza Mpro virusa SARS-CoV-2 predstavlja atraktivnu terapeutsku metu. Metodom informacionih spektara i potom molekulskim dokingom su i ranije predloženi potencijalni inhibitori SARS-CoV-2 glavne proteaze. Cilj ovog rada je izolovanje i prečišćavanje, a zatim ispitivanje aktivnosti proteaze Mpro SARS-CoV-2 u prisustvu različitih inhibitora. Plazmid koji sadrži gen za Mpro proteazu je uspešno izolovan i linearizovan. Mpro proteaza je uspešno eksprimirana u citosolu E. coli STAR ćelija. Merenjem enzimske aktivnosti utvrđena je inhibitorna aktivnost Vit C na Mpro. Takođe je utvrđeno da L-lizin i L-arginin imaju inhibitorno dejstvo na Mpro, ali nije postignuta IC50. Na ovaj način je potvrđena predložena inhibitorna aktivnost jedinjenja selektovanih in silico kao i razvijena metoda za merenje inhibitorne aktivnosti malih molekula na GST-Mpro proteazu virusa SARS-CoV-2.