Kloniranje fluorescentno obeleženog humanog α-sinukleina u vektore za ekspresiju u bakteriji Escherichia coli

Abstract

Humani α-sinuklein je protein zastupljen u završecima presinaptičkih neurona. Agregati ovog proteina su pronađeni u okviru amiloidnih fibrila i Lewy-jevih tela u mozgovima pacijenata sa Alchajmerovom, Parkinsonovom i drugim bolestima i smatra se da su usko povezani sa etiologijom ovih bolesti. Da bi se ispitale priroda ovog proteina i njegove oligomerizacije in vitro potrebne su velike količine prečišćenog proteina. U ovom radu opisana je konstrukcija vektora za ekspresiju humanog α-sinukleina fluorescentno obeleženog mCerulean3 proteinom sa His6, odnosno His8 tagom i uvedenim proteolitičkim mestom za TEV proteazu, koji nakon digestije oslobađa α-sinuklein sa nativom N-terminalnom aminokiselinom, a polazeći od komercijalno dostupnog pDUET-A- α-sinuclein-mCerulean3 vektora. Za dobijanje ekspresionog konstrukta, prvo je sintetisan insert PCR-om iz više ciklusa, nakon čega su PCR proizvodi subklonirani u pET-20b vektor, a zatim prebačeni u pDUET vektor. Sekvenca inserta u dobijenim konstruktima je potvrđena sekvenciranjem sa opdgovarajućim prajmerima.