Razvoj sendvič ELISA testa specifičnog za SARS-CoV-2 N-protein

Abstract

Ta na dijagnoza ljudi sa sumnjom na infekciju SARS-CoV-2 je od suštinskog zna aja za suzbijanje globalnog širenja COVID-19. Prisustvo SARS-CoV-2 može se otkriti RT-PCRom (otkriva RNK virusa) ili detekcijom prisustva virusnih antigena u biološkim te nostima ELISA-om ili sli nom tehnikom koje koriste antitela razvijena u životinjama. Cilj studije je bio uspostavljanje kvantitativnog testa koji se zasniva na koriš enju poliklonskih seruma za rutinsko odre ivanje koncentracije SARS-CoV-2 nukleokapsidnog proteina merenjam apsorbancije u standardnoj mikrotitarskoj plo ici sa 96 bunara. Za potrebe razvoja testa proizveden je rekombinantni N-protein i koriš en za proizvodnju antiseruma u miševima i ze evima. Proizvedeni antiserumi su pre iš eni i odre en im je titar. Poliklonskiantiserumi visokog afiniteta specifi ni za N-protein koriš eni su za razvoj ELISA testa specifi nog za ovaj protein. Test se zasniva na koriš enju poliklonskih seruma miševa koji su adherirani na dno bunara mikrotitarske plo ice za hvatanje N-proteina iz uzorka. Razli ite koncentracije rekombinantnog N-proteina su koriš ene za standardnu krivu za kvantifikaciju proteina. N-protein vezan za antitela miševa je detektovan ze jim poliklonskim serumom i anti-ze jim antitelom povezanim sa enzimom koji obezbe uje spektrofotometrijsko merenje. Uspešno smo razvili prototip ELISA testa za kvantifikaciju N-proteina sa granicom detekcije u opsegu od ng/mL. Prose na vrednost LOD za prototip ELISA testa za detekciju N-proteina je 9,2 ng/mL, dok je prose na vrednost LOQ 10,2 ng/mL. Pokazali smo da su proizvedeni poliklonski antiserumi pogodni za detekciju N-proteina sa sli nim ili boljim afinitetom i specifi noš u od komercijalnih antitela. Štaviše, prototip ELISA testa se može koristiti sa zadovoljavaju om pouzdanoš u za kvantifikaciju N-proteina u uzorcima bogatim proteinima, poput ljudskih seruma.

The accurate diagnosis of people with suspected infection with the SARS-CoV-2 is essential to curb the global spread of COVID-19. The presence of SARS-CoV-2 can be detected by RT-PCR (it detects RNA of the virus) or by the presence of viral antigens in biological fluids in ELISA or similar techniques using antibodies developed in animals. The aim of the study was the establishment of a quantitative polyclonal sera-based test for routine measurement of the concentration of SARS CoV-2 nucleocapsid protein using absorbance measurement in a standard 96-well microtiter plate. For the purposes of the test development, recombinant N protein was produced and used for the production of mice and rabbit antisera. Produced antisera were purified and titer was determined. High-affinity polyclonal N-protein specific antisera were used for N-protein specific ELISA test development. The test is based on mice polyclonal sera adhered to microtiter plate bottom for the capture of the N protein from the specimen. Various concentrations of the recombinant N-protein were used to generate a standard curve for protein quantification. The N-protein bound to the mice antibodies was detected with rabbit polyclonal sera and anti-rabbit antibody coupled to an enzyme that provides spectrophotometric measurement. We have successfully developed the prototype ELISA for the quantification of N-protein with the detection limit being in the range of ng/mL. The average LOD value for the prototype ELISA was determined to be 9.2 ng/mL, while the average LOQ value was 10.2 ng/mL. We have demonstrated that produced polyclonal antisera are suitable for the detection of N-protein with affinity and specificity similar to, or better than commercial antibodies. Furthermore, the prototype ELISA can be used with satisfactory confidence for quantification of the N-protein in protein-rich samples, similar to human sera.