Ekspresija, prečišćavanje i primena konstrukta H6IgM u imunoafinitetnoj hromatografiji

Abstract

Ekstracelularne vezikule, koje omogućavaju međućelijsku komunikaciju, pronašle su primenu u dijagnostici i tretmanu različitih bolesti. Pre nego što se upotrebe u dijagnostičke svrhe ili za isporuku terapeutika, egzozome je neophodno prečistiti iz različitih uzoraka, tehnikama u koje između ostalog spada i imunoafinitetna hromatografija. Nanoantitela, odnosno fragmenti antitela koji se mogu rekombinantno proizvesti koriste se u dijagnostičke i terapijske svrhe. Ona postaju sve više popularna zbog svoje sposobnosti da prepoznaju antigene nedostupne konvencionalnim antitelima. Upravo kompaktna struktura i visoka stabilnost su im omogućila široku primenu. Stoga nanoantitela se mogu koristiti za prepoznavanje i vezivanje specifičnih antigena na površini ekstracelularnih vezikula, omogućavajući njihovu detekciju i karakterizaciju. U ovom radu, uspešno je eksprimirano nanoantitelo H6IgM, u ćelijama E. Coli. Ovaj konstrukt je sačinjen od H6 nanoantitela i mišjijeg μ domena IgM antitela. H6 nanoantitelo je prethodno dobijeno direktnom selekcijom iz naivne biblioteke gena na antigenima egzozoma iz ćelijske kulture. H6 je okarakterisano kao anti-CD9 antitelo pa je potom dalje odabrano za dalja kloniranja u cilju proizvodnje konstrukta, koji bi vezivao vezikule iz različitih izvora. Nakon provere ekspresije, SDS-PAGE tehnikom, konstrukt je prečišćen metal-afinitetnom hromatografijom, zahvaljujući C terminalnom histidinskom tagu. Prinos nakon prečišćavanja je iznosio 1,2 mg/L. Gel hromatografijom procenjena je molekulska masa konstrukta na oko 25 kDa u odnosu na standard ( Lizozim 14 kDa). Immunocapture tehnikom, proveren je afinitet H6IgM za vezivanje egzozoma. Potom je protein vezan za polimetilakrilatni polimer i korišćen za izolovanje vezikula iz urina. U eluiranim frakcijama DLS metodom pokazano je prisustvo čestica, a njihov profil je analiziran SDS poliakrilamidnom elektroforezom.