Hemijska i enzimska hidroliza sulfata estrona i estradiola kao metoda za povećanje osetljivosti imunoeseja za estrogen na bazi fluorescentne polarizacije

Abstract

Određivanje nivoa estrogena u mleku jedan je od načina za ispitivanje gravidnosti krava. Cilj ovog rada je optimizacija postojećeg imunoeseja na bazi fluorescentne polarizacije za estron i estradiol, hemijskim i enzimskim prevođenjem konjugovanih oblika ovih hormona u slobodne oblike. Spektrofotometrijski je praćena hidroliza estradiol-sulfata pomoću vodenih rastvora hlorovodonične, perhlorne i trifluorsirćetne kiseline, kao i natrijum-hidroksida. Izvođenjem imunoeseja na bazi fluorescentne polarizacije uz promenljive koncentracije različitih oblika estrogena, kao i u prisustvu enzima sulfataze, ispitivana je enzimska hidroliza konjugovanih oblika. Eksperimenti su izvođeni u slanom fosfatnom puferu, a zatim i u realnom uzorku, mleku. Snimljeni su emisioni spektri mleka u dva pufera, sa nekoliko talasnih dužina eksitacije u opsegu 495-548 nm, kako bi se utvrdilo pri kojim talasnim dužinama eksitacije mleko daje najveći pozadinski signal. Uz prisustvo navedene tri kiseline i jedne baze u koncentracijama 0,5-0,6 M, u periodu od 30 minuta, nije došlo do hidrolize sulfata estrona i estradiola. Sulfataza u testu značajno poboljšava rezultate u PBS-u i povećava signal za rastvore konjugovanih oblika. Uslovi enzimske hidrolize su optimizovani tako da se test može izvesti na sobnoj temperaturi sa 15 minuta pripreme. Uprkos dobrim rezultatima čak i u mleku, test i dalje nije dovoljno osetljiv za detekciju koncentracija estrogena prirodno prisutnih u mleku krava u toku graviditeta. Pri korišćenju zračenja na 495 nm za pobuđivanje tragača na bazi fluorescein-izotiocijanata (FITC), mleko daje veoma intenzivan signal, dok pomeranje zračenja pobuđivanja za samo 10-20 nm ka crvenom delu spektra smanjuje pozadinski signal za više od 10 puta, pa je zaključeno da FITC nije idealna fluorofora za obeležavanje analita koji se mere u mleku.