Tiolna grupa Cys34 humanog serum-albumina : mogućnosti i značaj određivanja u kliničkoj praksi

Abstract

Humani serum albumin (HSA) ima više fizioloških funkcija, jedna od njih jeodbrana organizma od oksidativnog i/ili karbonilnog stresa. Istaknuta funkcija je posledicaprisustva jedne slobodne tiolne grupe ostatka Cys34 na površini njegovih molekula.Određivanje sadržaja HSA-SH grupa bi moglo biti pogodno za procenu stepenaoksidativnog i/ili karbonilnog stresa u različitim patološkim stanjima. Da bi našlo primenuu kliničkoj praksi, u prvom koraku potrebno je izolovati HSA iz seruma ili plazme, a potomodrediti sadržaj tiolnih grupa.Ispitivanjem pouzdanosti metode izolovanja HSA afinitetnom hromatografijom saCibacron Blue (CB) iz seruma zdravih osoba i dijabetičara, i kvantifikacije tiolne grupe,ustanovljeno je da je sadržaj HSA-SH grupa veći za 6 do 33 % od ukupnog sadržaju tiolaseruma, odnosno da je tačnost metode mala (recovery sadržaja HSA-SH grupa od 113,6 do130,1%). Utvrđena diskrepancija nije posledica uslova izolovanja (zapremina uzorka,karakteristike matriksa, protok kroz kolonu i vreme potrebno za izolovanje HSA iodređivanje sadržaja SH grupa), prisustva pufera za izolovanje i drugih proteina uizolovanom HSA (čistoće od 88,4 do 91,4 %), uticaja proteina, malih molekula i jonaprisutnih u serumu na određivanje HSA-SH, već selekcije HSA molekula od strane CBprema njihovoj konformaciji. Promena konformacije (utvrđena emisionom fluorescentnomspektroskopijom i CD), odnosno selekcija zavisi od vrste i broja molekula masnih kiselina(Mk) vezanih za HSA. Osim toga, priroda i broj Mk vezanih za HSA doprinose povećanjureaktivnosti HSA-SH grupa: konstanta brzine pseudo prvog reda za reakciju HSA-SHgrupe s DTNB u CB-vezanoj-HSA frakciji (21.74x10-3 s-1) je veća u odnosu na nevezanu-HSA frakciju (11.2x10-3 s-1), kao i u grupi dijabetičara (n=20) (20.9x10-3 s-1) u odnosu nakontrolnu grupu (n=17) (12.9x10-3 s-1). Recovery vrednosti sadržaja Cys34-SH grupa u CBvezanim-HSA frakcijama (od 98,5 do 101,7 %), dobijene nakon odmašćivanja HSA,potvrdile su da metoda izolovanja HSA afinitetnom hromatografijom nije pogodna zaodređivanje sadržaja HSA-SH grupa za kliničke svrhe.U cilju postizanja veće pouzdanosti u izvođenju zaključaka o promenama sadržajaHSA-SH grupa u različitim patološkim stanjima, optimizovana je metoda izolovanja HSAiz seruma dvostepenim taloženjem sa amonijum-sulfatom (AS) (zasićenje AS od 54 % uprvom i od 70 % u drugom koraku), sa prinosom HSA od 69,7 ± 4,4 %. Način taloženjaHSA (sa čvrstim AS-om ili zasićenim rastvorom AS-a) i uklanjanje AS-a iz izolovanogpreparata, ne utiče značajno na čistoću izolovanog HSA, u kojem je pored monomera(zastupljenost 91,9 ± 3,6 %) dokazano (SDS PAG elektroforezeom i imunoblotom)prisustvo dimera HSA (oko 10 %), tako de se predloženim postupkom izoluje HSA čistoćeoko 100 %. Predložena metoda je jednostavna, brza i jeftina, što je važno za kliničkupraksu. Omogućava precizno (RSD 3,2 %), tačno (recovery vrednost 101,2 ± 2,0 %, zaopseg fizioloških vrednosti od 0,25 do 0,75 mol-SH/mol HSA) i pouzdano (doprinos HSASHukupnom sadržaju tiola u serumu kod zdravih osoba iznosi 83,2 ± 5,3 %) određivanjesadržaja HSA-SH grupa. Predložena metoda može da se primeni i za izolovanje HSA izplazme (ne postoji statistički značajna razlika između sadržaja Cys34-SH grupa HSAizolovanog iz plazme ili seruma (0.574 ± 0.026; 0.570 ± 0.028 mol-SH/mol HSA, resp.).Mogućnost i značaj određivanja sadržaja HSA Cys34-SH grupe kao markera ukliničkoj praksi, proverena je određivanjem sadržaja HSA-SH grupa i ukupnih tiola ugrupi: obolelih od tipa 2 dijabetesa (n=23) i kontrolnoj grupi (n=17); kod trudnica sa (n=15)i bez preeklampsije (n=15). U oba patološka stanja, kod pacijenata sa tipom 2 dijabetesa isa preeklampsijom, dobijeno je statistički značajno smanjenje (p<0.05) sadržaja HSA-SHgrupa i ukupnih tiola seruma u odnosu na odgovarajuće kontrolne grupe. Određivanjesadržaja HSA Cys34-SH grupa se može primenjivati kao marker procene karbonilnogstresa u ovim patološkim stanjima. Pored toga, nađeno je da se reaktivnost tiolne grupeCys34 ostatka u ovim stanjima menja, što ima važne implikacije na mogućnost modulacijereaktivnosti (antioksidativnih svojstava) tiolne grupe pomoću suplemenata (na primer.masnih kiselina).

Human serum albumin (HSA) has a multitude of physiological functions, andone of them is to defend the organism against oxidative and/or carbonyl stress. Thisprominent function is enabled by the presence of single free Cys34 thiol group at thesurface of HSA molecules. Determination of HSA-SH group content could be a suitableparameter for oxidative and/or carbonyl stress level assesemnet in different pathologicalstates. In order to become aplicable in clinical practice, it is necessary to isolate HSAfrom serum or plasma in the first, and then to determine the content of thiol group.Monitoring of the reliability of affinity chromatography with Cibacron Blue(CB) for HSA isolation from serum of healthy and diabetic persons, and thiol groupquantification, showed that HSA-SH group content was higher from 6 to 33% than thetotal serum thiols content, i.e. that the accuracy of this method is low (HSA-SH groupcontent recovery ranging from 113.6 to 130.1%). This discrepancy is not caused by theisolation conditions (sample volume, matrix charateristics, column flow and the timeneeded for HSA isolation and SH group content determination), presence of buffer forHSA isolation and other proteins in isolated HSA preparation (purity range from 88.4 to91.4%), influence of proteins, small molecules and ions present in the serum on theHSA-SH content determination, but the selection of HSA molecules by CB according totheir conformations. The change in conformation (determined by emmission flourescentspectroscopy and CD), and accordingly the selection, depend on the type and thenumber of fatty acid (FA) molecules bound to HSA. Besides that, the nautre and thenumber of HSA bound FAs contribute to the increase in HSA-SH group reactivity:pseudo-first order rate constant for the reaction HSA-SH group with DTNB in CBbound fraction (21.74x10-3 s-1) is higher compared to unbound HSA fraction (11.2x10-3s-1), as well as in diabetic group (n=20) (20.9x10-3 s-1) compared to the controls (n=17)(12.9x10-3 s-1). Recovery values for Cys34-SH group content in CB bound HSAfractions (from 98,5 to 101,7 %), acquired after HSA defatting, confirmed that isolationof HSA by affinity chromatography is not suitable for determination of HSA-SH groupcontent in clinical practice.A two step ammonium sulphate (AS) precipitation method for HSA isolationfrom serum (AS saturation from 54% in first step and 70% in second step), with HSAyield of 69.7±4.4%, has been optimised in order to make more reliabile conclusionsabout the changes in HSA-SH group content in different pathological states. HSAprecipitation method (with solid AS or saturated AS solution) and the removal of ASfrom isolated preparation, has no significant influence on the purity of isolated HSA,where the presence of HSA dimer (about 10 %) was detected (by SDS PAGelectrophoresis and immunoblot) along with the HSA monomer (91.9%±3.6%abundance), so the purity of isolated HSA can be regarded as 100%. The proposedmethod is simple, fast and low cost, which is of greate importance for good clinicalpractice. It allows for precise (RSD 3,2%), accurate (with 101,2±2% recovery forphysiological values from 0,25 to 0,75 mol -SH/mol HSA) and reliable (HSA-SHcontribution to the total serum thiols content in healthy persons is 83,2 ± 5,3 %)determination of HSA-SH group content. In addition, proposed method could beaplicable for isolation of HSA from plasma samples (there is no significant statisticaldifferrence between the HSA Cys34-SH content isolated form plasma and serum (0.574± 0.026; 0.570 ± 0.028 mol-SH/mol HSA, resp.).The possibility and the importance of HSA Cys34-SH content determination as amarker in clinical practice, was tested by the determination of HSA-SH and total thiolscontent in group of: patients with diabetes mellitus type II (n=23) and control group(n=17); pregnant women with (n=15) and without preeclampsia (n=15). In bothpahtological states, in diabetic patients and pregnant women with preeclampsia, there isa statistically significant decrease (p<0.05) in HSA-SH group content as well as in totalserum thiols content compared to appropriate controls. Determination of HSA Cys34-SH content could be applied as a marker for carbonyl stress level assesement in thesepthological states. In addition, it was found that the reactivity of Cys34 thiol group inthese pathological states changes, which is an important implication for possiblemodulation of its reactivity (antioxidant properties) by supplements (eg. fatty acids).