Proteinski inženjering i razvoj visoko efikasnih metoda za pretraživanje biblioteke gena glukoza-oksidaze iz Aspergillus niger u cilju povećanja enzimske aktivnosti i stabilnosti
Protein engineering and development of high-throughput screening methods for Aspergillus niger glucose-oxidase gene library toward higher enzyme activity and stability.
Аутори
Kovačević, GordanaОстала ауторства
Prodanović, RadivojeGavrović-Jankulović, Marija
Baošić, Rada
Nikodinović-Runić, Jasmina
Докторска теза (Објављена верзија)
Метаподаци
Приказ свих података о документуАпстракт
Glukoza-oksidaza (GOx) je vaţan industrijski enzim koji se predominantno koristi kao biokatalizator u industriji hrane za proizvodnju glukonske kiseline, uklanjanje kiseonika i sterilizaciju. U farmaceutskoj industriji i kliničkoj biohemiji se koristi kao biosenzor za određivanje koncentracije glukoze, dok postoje pokušaji da se iskoristi i za proizvodnju biogorivnih ćelija koje proizvode električnu energiju koristeći glukozu i kiseonik iz ljudske krvi u okvirima nanobiotehnologije. Za rasprostranjeniju primenu GOx neophodno je unaprediti neke od njenih osobina kao što su aktivnost, pH optimum, reaktivnost sa kiseonikom i stabilnost. Jedna od metoda kojom se unapređuju proteini je dirigovana evolucija. Ova metoda podrazumeva iterativne tehnike generisanja biblioteka proteinskih mutanata (ili varijanti) i selekciju proteina sa odgovarajućom ţeljenom funkcijom iz ovih biblioteka.U cilju pronalaţenja mutanata GOx iz Aspergillus niger koji su oksidativno stabilniji i aktivniji, u ovom radu... su razvijene dve metode pretraţivanja bazirane na ekspresiji proteina na površini ćelija kvasca. Pored razvoja metoda pretraţivanja ispitivana je i optimizacija ekspresije rekombinantne GOx u kvascu Pichia pastoris za heterolognu ekspresiju mutanata GOx i njihovu kinetičku karakterizaciju.Oksidacija bočnih ostataka amino kiselina je jedan od glavnih razloga nestabilnosti nativne trodimenzionalne strukture GOx. Posebno osetljiv prema oksidaciji je metionin, koji se prevodi u metionin-sulfoksid čak i pod blagim uslovima u prisustvu kiseonika i kiseoničnih reaktivnih vrsta kao što su vodonik-peroksid, superoksid anjon radikal i drugi. Da bi utvrdili uticajpozicije metionina na oksidativnu stabilnost GOx, svih 11 metionina je razmatrano za mesto specifičnu mutagenezu...
Glucose-oxidase (GOx) is an important industrial enzyme that is predominantly used as a biocatalyst in the food industry for the production of gluconic acid, oxygen removal and sterilization. In the pharmaceutical industry and clinical biochemistry it is used as a biosensor for determining glucose concentration, while there are attempts to utilize it in the production of biofuel cells that produce electricity using glucose and oxygen from human blood within the framework of nanobiotechnology. For the widespread use of GOx it is necessary to improve some of its properties such as activity, pH optimum, reactivity with oxygen and stability. One of the methods for improving proteins is directed evolution. This method involves iterative techniques for generating libraries of protein mutants (or variants) and selecting proteins with the desired function from these libraries.In order to find GOx mutants from Aspergillus niger that are oxidatively more stable and active, in this work two metho...ds of screening based on protein expression on the surface of yeast cells have been developed. In addition to the development of the screening methods, the optimization of the expression of recombinant GOx in yeast Pichia pastoris for heterologous expression of GOx mutants and their kinetic characterization was studied.Aminoacid side chain oxidation is one of the main causes for structural instability of native tridimensional structure of GOx. Particularly sensitive to oxidation is methionine residue, which is converted to methionine sulfoxide even under mild conditions in the presence of oxygen and oxygen reactive species such as hydrogen peroxide, superoxide anion radical and others. In order to determine the effect of the position of the methionine amino acidresidue on the oxidative stability of GOx, all 11 methionines were considered for site directed mutagenesis...
Кључне речи:
glukoza-oksidaza, visoko efikasne metode pretraţivanja, oksidativna stabilnost, ekspresija na površini ćelija kvasca, zeleni fluorescentni protein, Pichia pastoris / glucose oxidase, high-throughput screening, oxidative stability, yeast surface display, green fluorescent protein, Pichia pastorisИзвор:
Универзитет у Београду, 2018Издавач:
- Универзитет у Београду, Хемијски факултет
Финансирање / пројекти:
- Алергени, антитела, ензими и мали физиолошки значајни молекули: дизајн, структура, функција и значај (RS-172049)
URI
http://eteze.bg.ac.rs/application/showtheses?thesesId=6425https://fedorabg.bg.ac.rs/fedora/get/o:19139/bdef:Content/download
http://vbs.rs/scripts/cobiss?command=DISPLAY&base=70036&RID=50764559
http://nardus.mpn.gov.rs/123456789/10586
https://cherry.chem.bg.ac.rs/handle/123456789/3167
Колекције
Институција/група
Hemijski fakultet / Faculty of ChemistryTY - THES AU - Kovačević, Gordana PY - 2018 UR - http://eteze.bg.ac.rs/application/showtheses?thesesId=6425 UR - https://fedorabg.bg.ac.rs/fedora/get/o:19139/bdef:Content/download UR - http://vbs.rs/scripts/cobiss?command=DISPLAY&base=70036&RID=50764559 UR - http://nardus.mpn.gov.rs/123456789/10586 UR - https://cherry.chem.bg.ac.rs/handle/123456789/3167 AB - Glukoza-oksidaza (GOx) je vaţan industrijski enzim koji se predominantno koristi kao biokatalizator u industriji hrane za proizvodnju glukonske kiseline, uklanjanje kiseonika i sterilizaciju. U farmaceutskoj industriji i kliničkoj biohemiji se koristi kao biosenzor za određivanje koncentracije glukoze, dok postoje pokušaji da se iskoristi i za proizvodnju biogorivnih ćelija koje proizvode električnu energiju koristeći glukozu i kiseonik iz ljudske krvi u okvirima nanobiotehnologije. Za rasprostranjeniju primenu GOx neophodno je unaprediti neke od njenih osobina kao što su aktivnost, pH optimum, reaktivnost sa kiseonikom i stabilnost. Jedna od metoda kojom se unapređuju proteini je dirigovana evolucija. Ova metoda podrazumeva iterativne tehnike generisanja biblioteka proteinskih mutanata (ili varijanti) i selekciju proteina sa odgovarajućom ţeljenom funkcijom iz ovih biblioteka.U cilju pronalaţenja mutanata GOx iz Aspergillus niger koji su oksidativno stabilniji i aktivniji, u ovom radu su razvijene dve metode pretraţivanja bazirane na ekspresiji proteina na površini ćelija kvasca. Pored razvoja metoda pretraţivanja ispitivana je i optimizacija ekspresije rekombinantne GOx u kvascu Pichia pastoris za heterolognu ekspresiju mutanata GOx i njihovu kinetičku karakterizaciju.Oksidacija bočnih ostataka amino kiselina je jedan od glavnih razloga nestabilnosti nativne trodimenzionalne strukture GOx. Posebno osetljiv prema oksidaciji je metionin, koji se prevodi u metionin-sulfoksid čak i pod blagim uslovima u prisustvu kiseonika i kiseoničnih reaktivnih vrsta kao što su vodonik-peroksid, superoksid anjon radikal i drugi. Da bi utvrdili uticajpozicije metionina na oksidativnu stabilnost GOx, svih 11 metionina je razmatrano za mesto specifičnu mutagenezu... AB - Glucose-oxidase (GOx) is an important industrial enzyme that is predominantly used as a biocatalyst in the food industry for the production of gluconic acid, oxygen removal and sterilization. In the pharmaceutical industry and clinical biochemistry it is used as a biosensor for determining glucose concentration, while there are attempts to utilize it in the production of biofuel cells that produce electricity using glucose and oxygen from human blood within the framework of nanobiotechnology. For the widespread use of GOx it is necessary to improve some of its properties such as activity, pH optimum, reactivity with oxygen and stability. One of the methods for improving proteins is directed evolution. This method involves iterative techniques for generating libraries of protein mutants (or variants) and selecting proteins with the desired function from these libraries.In order to find GOx mutants from Aspergillus niger that are oxidatively more stable and active, in this work two methods of screening based on protein expression on the surface of yeast cells have been developed. In addition to the development of the screening methods, the optimization of the expression of recombinant GOx in yeast Pichia pastoris for heterologous expression of GOx mutants and their kinetic characterization was studied.Aminoacid side chain oxidation is one of the main causes for structural instability of native tridimensional structure of GOx. Particularly sensitive to oxidation is methionine residue, which is converted to methionine sulfoxide even under mild conditions in the presence of oxygen and oxygen reactive species such as hydrogen peroxide, superoxide anion radical and others. In order to determine the effect of the position of the methionine amino acidresidue on the oxidative stability of GOx, all 11 methionines were considered for site directed mutagenesis... PB - Универзитет у Београду, Хемијски факултет T2 - Универзитет у Београду T1 - Proteinski inženjering i razvoj visoko efikasnih metoda za pretraživanje biblioteke gena glukoza-oksidaze iz Aspergillus niger u cilju povećanja enzimske aktivnosti i stabilnosti UR - https://hdl.handle.net/21.15107/rcub_nardus_10586 ER -
@phdthesis{ author = "Kovačević, Gordana", year = "2018", abstract = "Glukoza-oksidaza (GOx) je vaţan industrijski enzim koji se predominantno koristi kao biokatalizator u industriji hrane za proizvodnju glukonske kiseline, uklanjanje kiseonika i sterilizaciju. U farmaceutskoj industriji i kliničkoj biohemiji se koristi kao biosenzor za određivanje koncentracije glukoze, dok postoje pokušaji da se iskoristi i za proizvodnju biogorivnih ćelija koje proizvode električnu energiju koristeći glukozu i kiseonik iz ljudske krvi u okvirima nanobiotehnologije. Za rasprostranjeniju primenu GOx neophodno je unaprediti neke od njenih osobina kao što su aktivnost, pH optimum, reaktivnost sa kiseonikom i stabilnost. Jedna od metoda kojom se unapređuju proteini je dirigovana evolucija. Ova metoda podrazumeva iterativne tehnike generisanja biblioteka proteinskih mutanata (ili varijanti) i selekciju proteina sa odgovarajućom ţeljenom funkcijom iz ovih biblioteka.U cilju pronalaţenja mutanata GOx iz Aspergillus niger koji su oksidativno stabilniji i aktivniji, u ovom radu su razvijene dve metode pretraţivanja bazirane na ekspresiji proteina na površini ćelija kvasca. Pored razvoja metoda pretraţivanja ispitivana je i optimizacija ekspresije rekombinantne GOx u kvascu Pichia pastoris za heterolognu ekspresiju mutanata GOx i njihovu kinetičku karakterizaciju.Oksidacija bočnih ostataka amino kiselina je jedan od glavnih razloga nestabilnosti nativne trodimenzionalne strukture GOx. Posebno osetljiv prema oksidaciji je metionin, koji se prevodi u metionin-sulfoksid čak i pod blagim uslovima u prisustvu kiseonika i kiseoničnih reaktivnih vrsta kao što su vodonik-peroksid, superoksid anjon radikal i drugi. Da bi utvrdili uticajpozicije metionina na oksidativnu stabilnost GOx, svih 11 metionina je razmatrano za mesto specifičnu mutagenezu..., Glucose-oxidase (GOx) is an important industrial enzyme that is predominantly used as a biocatalyst in the food industry for the production of gluconic acid, oxygen removal and sterilization. In the pharmaceutical industry and clinical biochemistry it is used as a biosensor for determining glucose concentration, while there are attempts to utilize it in the production of biofuel cells that produce electricity using glucose and oxygen from human blood within the framework of nanobiotechnology. For the widespread use of GOx it is necessary to improve some of its properties such as activity, pH optimum, reactivity with oxygen and stability. One of the methods for improving proteins is directed evolution. This method involves iterative techniques for generating libraries of protein mutants (or variants) and selecting proteins with the desired function from these libraries.In order to find GOx mutants from Aspergillus niger that are oxidatively more stable and active, in this work two methods of screening based on protein expression on the surface of yeast cells have been developed. In addition to the development of the screening methods, the optimization of the expression of recombinant GOx in yeast Pichia pastoris for heterologous expression of GOx mutants and their kinetic characterization was studied.Aminoacid side chain oxidation is one of the main causes for structural instability of native tridimensional structure of GOx. Particularly sensitive to oxidation is methionine residue, which is converted to methionine sulfoxide even under mild conditions in the presence of oxygen and oxygen reactive species such as hydrogen peroxide, superoxide anion radical and others. In order to determine the effect of the position of the methionine amino acidresidue on the oxidative stability of GOx, all 11 methionines were considered for site directed mutagenesis...", publisher = "Универзитет у Београду, Хемијски факултет", journal = "Универзитет у Београду", title = "Proteinski inženjering i razvoj visoko efikasnih metoda za pretraživanje biblioteke gena glukoza-oksidaze iz Aspergillus niger u cilju povećanja enzimske aktivnosti i stabilnosti", url = "https://hdl.handle.net/21.15107/rcub_nardus_10586" }
Kovačević, G.. (2018). Proteinski inženjering i razvoj visoko efikasnih metoda za pretraživanje biblioteke gena glukoza-oksidaze iz Aspergillus niger u cilju povećanja enzimske aktivnosti i stabilnosti. in Универзитет у Београду Универзитет у Београду, Хемијски факултет.. https://hdl.handle.net/21.15107/rcub_nardus_10586
Kovačević G. Proteinski inženjering i razvoj visoko efikasnih metoda za pretraživanje biblioteke gena glukoza-oksidaze iz Aspergillus niger u cilju povećanja enzimske aktivnosti i stabilnosti. in Универзитет у Београду. 2018;. https://hdl.handle.net/21.15107/rcub_nardus_10586 .
Kovačević, Gordana, "Proteinski inženjering i razvoj visoko efikasnih metoda za pretraživanje biblioteke gena glukoza-oksidaze iz Aspergillus niger u cilju povećanja enzimske aktivnosti i stabilnosti" in Универзитет у Београду (2018), https://hdl.handle.net/21.15107/rcub_nardus_10586 .